Gélová permeačná chromatografia
Gélová permeačná chromatografia (GPC), niekedy označovaná aj ako chromatografia s vylúčením veľkosti (SEC), je separačná metóda založená na princípe rozdielov veľkosti a tvaru molekúl, pri ktorej je separácia takmer nezávislá od fyzikálno-chemických vlastností separovaných látok. Stacionárna fáza pozostáva z inertného nerozpustného polymérneho gélu, ktorý vytvára sieť s definovanou veľkosťou pórov gélu. Stacionárna fáza je umiestnená v kolóne, cez ktorú kontinuálne prechádza mobilná fáza. Proces separácie závisí predovšetkým od charakteru stacionárnej fázy (veľkosť, tvar, množstvo a relatívny objem pórov gélu) a ďalej závisí od veľkosti a distribúcie častíc stacionárnej fázy. Separačný proces závisí aj od povahy mobilnej fázy a jej prietoku. Po vstreknutí separovanej látky do systému GPC je vzorka unášaná mobilnou fázou smerom k separačnej kolóne. Častice s nízkou relatívnou molekulovou hmotnosťou môžu difundovať do pórov gélu, čo spôsobuje ich oneskorenie voči mobilnej fáze. Naopak látky s vysokou relatívnou molekulovou hmotnosťou nemôžu difundovať do gélových pórov a sú unášané prúdom mobilnej fázy smerom k detektoru alebo zberaču frakcií. Z toho vyplýva, že látky s vysokou relatívnou molekulovou hmotnosťou sa eluujú zo separačnej kolóny ako prvé a látky s najnižšou relatívnou molekulovou hmotnosťou opúšťajú kolónu ako posledné.
GPC ako nástroj na prácu s polymérmi a čistenie proteínov
GPC našla svoje uplatnenie predovšetkým pri určovaní relatívnych molekulových hmotností a distribúcie molekulových hmotností syntetických polymérov a biopolymérov. Čistenie proteínov je oblasť, v ktorej GPC našla uplatnenie. Ďalším odvetvím, v ktorom GPC našla uplatnenie, je potravinársky priemysel, kde sa používa napríklad pri analýze želatínov a škrobov.
Detektory pre gélovú permeačnú chromatografiu
Detektor indexu lomu pre gélovú permeačnú chromatografiu
Detektor indexu lomu alebo refraktometrický detektor je najčastejšie používaným detektorom v spojení so systémami GPC/SEC. Detektor refrakčného indexu je založený na meraní zmien indexu lomu mobilnej fázy prúdiacej cez meraciu kyvetu. Meranie zmien indexu lomu je diferenciálne, t. j. zmena indexu lomu sa meria vzhľadom na referenčnú bunku. Refraktometrický detektor dokáže detegovať všetky látky, ktorých index lomu je dostatočne odlišný od indexu lomu mobilnej fázy. Nevýhodou refraktometrického detektora je závislosť indexu lomu od teploty a tlaku, a preto sa teplota v refraktometrickom detektore prísne kontroluje.
Použitím detektora indexu lomu ako jediného detektora v systéme GPC/SEC možno určiť relatívne koncentrácie rôznych dátových plôch v píku vzorky, čo v kombinácii s kalibračnou krivkou umožňuje výpočet relatívnych momentov molekulovej hmotnosti (Mn, Mw, Mz). Ak sa refraktometrický detektor skombinuje s detektorom rozptylu svetla a viskozimetrickým detektorom, možno určiť presnú koncentráciu vzorky v každom dátovom plátku a s jej znalosťou vypočítať absolútnu molekulovú hmotnosť a vnútornú viskozitu. Presná koncentrácia vzorky v každom dátovom reze sa teda získava pomocou hodnoty dn/dc vzorky.
Spoločnosť MALVERN Panalytical používa vysoko citlivý modul detektora indexu lomu v systéme OMNISEC REVEALGPC na presné meranie koncentrácie vzorky alebo hodnoty dn/dc.
Detektor sa používa na určenie koncentrácie vzorky. Jeho robustná prietoková bunka sa udržiava v sérii s ostatnými detektormi, aby sa dosiahla maximálna citlivosť. Tento modulárny diferenciálny detektor indexu lomu je umiestnený v prostredí, v ktorom možno regulovať teplotu až do 55 °C, aby sa zlepšila stabilita základného signálu. Reguláciu teploty možno tiež vypnúť, aby fungoval pri teplote okolia, napríklad v chladiacej miestnosti alebo chladiacom boxe. Prietoková 9 μl meracia bunka minimalizuje rozšírenie pásma.
UV/Vis detektory pre gélovú permeačnú chromatografiu
UV detektory pracujú buď pri pevnej vlnovej dĺžke, alebo sa vlnová dĺžka môže meniť v závislosti od analytu. Absorpcia UV žiarenia sa riadi Lambertovým-Beerovým zákonom, podľa ktorého je množstvo absorbovaného žiarenia funkciou počiatočnej intenzity žiarenia, dĺžky optickej dráhy lúča v kyvete, koncentrácie analytu a jeho molárneho absorpčného koeficientu.
Použitie UV detektora je obmedzené absorpciou eluentu pri pracovnej vlnovej dĺžke.
UV/Vis detektory možno rozdeliť na detektory s pevnou vlnovou dĺžkou, najčastejšie 254 nm, a detektory s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou alebo UV/Vis DAD, t. j. detektory s diódovým poľom, ktoré zaznamenávajú celé spektrum vlnových dĺžok. Používajú sa ako detektory na koncentráciu vzoriek chromofóru a na meranie dA/dc.
Spoločnosť MALVERN používa detektor s UV-fotodiódovým poľom vsystéme OMNISEC REVEAL DAD na dosiahnutie citlivých a presných meraní absorbancie UV a viditeľného svetla. Súčasne meria všetky vlnové dĺžky v rozsahu 190 až 900 nm pomocou sústavy 1024 diód. Na identifikáciu materiálov s rôznymi spektrami a vlnovými dĺžkami maximálnej absorbancie vzorky možno použiť úplné spektrálne 2D a 3D zobrazenie.
Detektor viskozity
Detektor viskozity pozostáva zo štyroch kapilár zostavených do „Wheatstonovho“ mostíka. Ak cez detektor preteká len čisté rozpúšťadlo, všetky kapiláry sú naplnené týmto rozpúšťadlom. Keď do detektora viskozity začne prúdiť eluát zo systému GPC/SEC, tento eluát naplní kapiláry 1, 2 a 4, zatiaľ čo kapilára 3 obsahuje čisté rozpúšťadlo. V dôsledku zvýšenia viskozity v kapilárach 1, 2 a 4 v porovnaní s kapilárou 3 vzniká vo „Wheatstonovom“ mostíku tlaková nerovnováha, ktorá sa meria tlakovým snímačom. Vstupný tlak (vstupný tlakový kolík) a diferenčný tlak sú priamo úmerné špecifickej viskozite roztoku polyméru.
Keďže merané koncentrácie roztokov polymérov sú veľmi nízke, je možné priamo určiť hraničné viskozitné číslo. Kombinácia refraktometrického a viskozitného detektora poskytuje presné stanovenie molárnej hmotnosti pre všetky typy polymérov, na ktoré možno použiť univerzálnu kalibráciu. Pomocou merania viskozity možno okrem stanovenia vnútornej viskozity a hydrodynamického polomeru získať cenné informácie o stupni rozvetvenia, ktoré nie sú k dispozícii len s refraktometrickým detektorom.
Systém OMNISEC REVEAL spoločnosti MALVERN je vhodným nástrojom na citlivé a presné meranie vnútornej viskozity syntetických a prírodných polymérov a proteínov. V rámci opísanej konštrukcie Wheatstonovho mostíka obsahuje patentovaný jednorazový kapilárny samovyvažovací mostík, ktorý možno ľahko vymeniť, ako aj automatický vyvažovací mechanizmus pre maximálnu stabilitu, citlivosť a robustnosť merania. Prevodníky sú vyrobené z nehrdzavejúcej ocele 316 pre maximálnu kompatibilitu s mobilnou fázou v širokom rozsahu pH a koncentrácií solí. Okrem toho konštrukcia obsahuje vysoko odolný prevodník diferenčného tlaku na obmedzenie rizika poškodenia počas prevádzky.
Detektory rozptylu svetla
Ďalším typom detektora, ktorý možno použiť na stanovenie molárnej hmotnosti vzorky, je detektor rozptylu svetla. Počas merania prechádza laserový lúč do kyvety obsahujúcej eluát, ktorý opúšťa chromatografickú kolónu. Dopadajúci primárny laserový lúč je rozptýlený rozpustenými molekulami analytu. Intenzita rozptýleného svetla je úmerná veľkosti častíc, rozdielu indexu lomu a koncentrácii častíc. Molárna hmotnosť meraná detektorom rozptylu sa určuje pomocou Rayleighovej rovnice, ktorú možno zjednodušiť takto:
kde R(θ) je intenzita rozptýleného svetla pri uhle θ, C je koncentrácia častíc v roztoku, M je priemerná molárna hmotnosť a K je optická konštanta.
Na výpočet molárnej hmotnosti sa R(θ) musí určiť pri nulovom uhle rozptylu. To sa dá dosiahnuť použitím detektora „Low Angle LightScattering“ (LALS), čo je detektor, ktorý rozptyľuje svetlo pod uhlom menším ako 10° k primárnemu lúču.
Spoločnosť MALVERN používa vo svojom systéme OMNISEC REVEAL jedinečný detektor rozptylu svetla RALS/LALS. Tento detektor obsahuje pravouhlý (RALS) a nízkouhlý (LALS) detektor. RALS maximalizuje citlivosť pri meraní materiálov s nízkou molekulovou hmotnosťou, zatiaľ čo LALS maximalizuje presnosť molekulovej hmotnosti pri vzorkách s vysokou Mw. Detektor RALS detekuje rozptýlené svetlo pod uhlom 90°. Môže merať molekulovú hmotnosť s vysokou citlivosťou pre vzorky, ktoré rozptyľujú svetlo izotropne, t. j. rovnako vo všetkých smeroch; nemôže však merať molekulovú hmotnosť pre anizotropné rozptyľovače (ovplyvnené uhlovou závislosťou).
- Detektor LALS zbiera rozptýlené svetlo pod uhlom 7°. Dokáže merať molekulovú hmotnosť všetkých molekúl, ale má nižší pomer signálu k šumu.
- Kombináciou detektorov RALS a LALS možno merať molekulovú hmotnosť všetkých vzoriek a zároveň maximalizovať pomer signál/šum.
- Táto kombinácia sa preto používa na citlivé a presné merania absolútnej molekulovej hmotnosti syntetických a prírodných polymérov a proteínov.
VYSVETLENIE TECHNOLÓGIÍ STATICKÉHO ROZPTYLU SVETLA PRE GPC/SEC
Detektory s viacerými uhlami
Ďalšou možnosťou určenia molárnej hmotnosti je meranie rozptýleného svetla pod rôznymi uhlami a následná extrapolácia na „nulový“ uhol. V tomto druhom prípade hovoríme o takzvanom detektore „Multi Angle Light Scattering“ (MALS). Pomocou týchto detektorov rozptylu sa dá určiť priemerná molárna hmotnosť aj veľkosť častíc (gyračný polomer). MALS môže merať molekulovú hmotnosť pre izotropné aj anizotropné rozptyľujúce látky. Môže tiež merať polomer gyrácie pre anizotropne rozptyľujúce častice.
MALVERN Panalytical používa detektory Viscotek SEC-MALS 20 a SEC-MALS 9.
Detektor SEC-MALS – 20 citlivo detekuje svetlo pomocou rozptylového systému s 20 detektormi usporiadanými od 12 do 164 stupňov s reguláciou teploty do 60 °C. Vertikálna konštrukcia prietokovej bunky zvyšuje presnosť a opakovateľnosť merania a zabezpečuje, že potreba čistenia bunky je výrazne znížená. Detektor s 20 uhlami meria od menej ako 1 000 do viac ako 10^7 daltonov s vynikajúcou citlivosťou a presnosťou. Vyžaduje prítomnosť detektora indexu lomu (RI) alebo UV žiarenia a analógový výstup.
Detektor SEC – MALS 9 využíva rovnakú vertikálnu prietokovú komoru s radiálnou optickou konštrukciou ako SEC – MALS 20 a tiež dosahuje vysokú citlivosť a nízky odstup signál/šum.
Pracuje s uhlami rozptylu 28°, 44°, 60°, 76°, 90°, 108°, 124°, 140°, 156° a objemom prietokovej bunky 63 mikrolitrov.
Kombinované detektory
Pri detekcii a charakterizácii chemicky heterogénnych systémov, ako sú vzorky biologického pôvodu, zmesi nízkomolekulových látok a polymérov alebo kopolymérov, je často nevyhnutné súčasné použitie viacerých detekčných princípov. V takýchto prípadoch je najjednoduchšie kombinovať dva alebo viac detektorov v sérii.
Príkladom sú takzvané duálne detektory, ktoré súčasne merajú absorpciu svetla pri dvoch vlnových dĺžkach, alebo UV absorpciu a zmeny indexu lomu.
V moderných prístrojoch sa často stretávame s kombinovanou detekciou, ktorá umožňuje stanovenie absolútnych hodnôt molárnych hmotností a štruktúrnych charakteristík polymérov. Príkladom sú duálne detektory kombinujúce refraktometer (zisťovanie koncentrácie) a viskozimeter (zisťovanie viskozity), refraktometer a detektor rozptylu svetla a napokon takzvané „trojité“ alebo dokonca „quattro“ usporiadanie detektorov, ktoré kombinuje refraktometer, UV/Vis detektor, viskozimeter a detektor rozptylu svetla v sérii.
MALVERN Panalytical je jediným výrobcom systému gélovej permeačnej chromatografie s komplexným integrovaným systémom až štyroch detektorov umiestnených v jednom tepelne stabilizovanom bloku (OMNISEC RESOLVE). Tento kompletný systém sa dodáva so softvérom na riadenie, meranie a vyhodnocovanie údajov vrátane diagnostiky.
