Charakterizácia extracelulárnych vezikul
Extracelulárne vezikuly (EV) alebo exozómy sa dostávajú do popredia výskumu vďaka svojmu terapeutickému a diagnostickému potenciálu. Sú to malé membránové štruktúry uvoľňované bunkami do ich okolia, ktoré sa podieľajú na medzibunkovej komunikácii, transporte molekúl a ďalších pre organizmus dôležitých funkciách. Na ich charakterizáciu existuje niekoľko analytických metód, ktoré by sa dali rozdeliť na metódy charakterizujúce extracelulárne vezikuly v zmysle častíc a metódy, ktoré charakterizujú ich obsah. Medzi druhé spomínané patrí napríklad metóda western blot na detekciu špecifických proteínov, hmotnostná spektrometria na stanovenie proteínového, lipidového a metabolomického obsahu, alebo PCR na stanovenie špecifickej nukleovej kyseliny. Vzhľadom na malé rozmery extracelulárnych vezikúl existuje aj celý rad prístupov pre ich charakterizáciu v zmysle častíc. Naša spoločnosť ANAMET s.r.o. ponúka kompletné portfólio techník pre ich charakterizáciu, o ktorých sa dočítate nižšie.
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
NTA je technológia používaná na meranie distribúcie veľkostí a koncentrácie častíc v suspenzii. Využíva svetelný rozptyl na detekciu jednotlivých častíc a sleduje ich Brownov pohyb. Prepočtom sa potom vypočíta ich rozmer a koncentrácia. Veľkou výhodou tejto technológie je možnosť merania suspenzie častíc s rôznym zložením bez nutnosti poznať index lomu častíc, rovnako jej nerobia problém polydisperzné systémy. V našom portfóliu je táto technika zastúpená prístrojovým radom NanoSight od spoločnosti Malvern Panalytical. Veľkosť častíc je meraná v rozmedzí 10–1000 nm a vezikuly (od 40 nm) sú zobrazené v reálnom čase vrátane video záznamu ich pohybu. NanoSight taktiež disponuje možnosťou fluorescenčného merania pri vlnovej dĺžke príslušného laserového modulu a tak je možné aj čiastočne určiť fenotyp EV. Technológia NTA je vďaka svojim vlastnostiam úplne ideálna na meranie veľkosti a koncentrácie častíc a NanoSight sa tak stáva popredným nástrojom pre charakterizáciu extracelulárnych vezikúl z hľadiska veľkosti, koncentrácie a pôvodu pomocou fluorescenčného značenia.
Dynamický rozptyl svetla (DLS)
DLS je metóda používaná na meranie distribúcie veľkostí, koncentrácie a zeta potenciálu EV na základe rozptylu svetla. Táto metóda je vhodná na analýzu častíc v suspenziách avšak horšie si poradí s polydisperzitou extracelulárnych vezikúl alebo s heterogénnymi vzorkami. Nami ponúkaný DLS analyzátor ZetaSizer od Malvern Panalytical potrebuje pre analýzu výrazne menej vzorky ako vyššie zmienený NanoSight. Výhodou je tiež možnosť merania zeta potenciálu, ktorý poskytuje informácie o povrchovom náboji vezikúl. To je dôležité pre pochopenie stability vezikúl v suspenzii a ich interakcií s bunkovými membránami.
Elektronová mikroskopia (EM)
Veľmi rozšírenou metódou pre vizualizáciu EV je elektronová mikroskopia, ktorá ponúka vysoké rozlíšenie jednotlivých vezikúl. Existujú dva hlavné typy EM, ktoré sa používajú: transmisná elektronová mikroskopia (TEM) a skenovacia elektronová mikroskopia (SEM). SEM umožňuje detailné zobrazenia povrchu EV a sstolnové SEM mikroskopy radu Phenom od Thermo Scientific s kryodržiakom sú univerzálnou voľbou pre vašu laboratóriu.
Prietoková cytometria
Táto metóda umožňuje kvantitatívnu analýzu jednotlivých EV na základe ich veľkosti a povrchových markerov. Prietoková cytometria využíva laserové svetlo k detekcii fluorescenčných značiek naviazaných na špecifické proteíny vezikúl a vďaka viacerým detektorom možno tiež charakterizovať ich fenotyp. FlowNanoanalyzer od NANOFCM je špecifickým typom prietokovej cytometrie navrhnutý pre citlivú charakterizáciu nanočastíc vrátane extra celulárnych vezikúl. Okrem rozptylu svetla slúžiaceho na výpočet veľkosti častíc na základe kalibrácie SiO2 štandardov zaznamenáva tiež fluorescenčný signál, takže získava informácie o pôvode či zložení častíc.
Mikroskopia atomárných síl (AFM)
AFM umožňuje zobrazovanie EV s nanometrovým rozlíšením, vďaka čomu poskytuje detailné informácie o ich morfológii, veľkosti, tvare a povrchových vlastnostiach. Pomocou AFM možno merať aj mechanické vlastnosti vezikúl, ako je ich tuhosť nebo elasticita, čo je užitočné pre pochopenie ich funkčných vlastností. V našom portfóliu nájdete celú radu AFM analyzátorov od spoločnosti NanoSurf.
Mikroskopia atómových síl (AFM)
Ďalšími metódami na charakterizáciu EV sú fluorescenčná korelačná spektrospokia (FCS) a mikroskopia so stimulovanou emisnou depléciou (STED). FCS využíva fluorescenčné vlastností vezikúl a vďaka fluktuácii fluorescenčného signálu zisťuje ich veľkosť a koncentráciu. Je vhodná predovšetkým na skúmanie vezikúl v interakciách s biomolekulami ako sú napríklad proteíny alebo nukleové kyseliny. Technika STED umožňuje charakterizáciu vezikul pod difrakčným limitom bežnej fluorescenčnej mikroskopie a prináša tak extrémne vysoké priestorové rozlíšenie povrchovej štruktúry a morfológie vezikúl.
Charakterizácia extra mobilných vezikul vyžaduje kombináciu niekoľkých metód a naša firma ANAMET ponúka ich kompletné portfólio. Pre komplexnú analýzu je teda nutné často použiť niekoľko techník, ktoré sa dopĺňajú a vďaka nám máte tieto techniky k dispozícii.